最直接最灵敏的检测手段。
培养时间长，需3-5周才能判断。有些支原体不能在培养基上培养出来（例如M. hyorhinis）。需要同时培养支原体菌株作阳性对照，可能会造成污染。
葡萄糖、L-盐酸精氨酸、Difco PPLO broth（Difco 0554-17-1）、马血清、15%酵母膏溶液（高压灭菌）、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管（高压灭菌）、无菌培养皿（60x15mm）、玻璃棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应该用无菌水，每次打开厌氧缸后用70%酒精擦拭内壁。）
培养基准备： 基本配方为Difco PPLO broth（60%），马血清（20%），15%酵母膏溶液（10%），10x储存液（10%）。由于培养时间长，可加50u/ml青霉素至10x储存液或加入乙酸铊（1：2000）至培养基中以防止其他细菌的污染。
10x储存液（1升）： 称取50克葡萄糖，10克L-盐酸精氨酸溶于1升蒸馏水中。用0.22μm无菌过滤膜过滤除菌，分装100ml至瓶中，-70℃保存。
液体培养基（1升）： 称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解。灭菌121℃15分钟灭菌。待温度降低至室温后于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解冻的10x储存液，混合均匀后分装至已灭菌的有盖螺旋试管中，10ml/管。4℃保存，保存期限为1个月。
固体培养基： 称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红，15克Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解。121℃15分钟灭菌，放入50℃水浴中，待温度降至50℃时于无菌超净台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及解冻的10x储存液，混合均匀后倒入60x15mm无菌培养皿中，5ml/皿。保存于4℃，期限为1个月。
取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液接种于液体培养基中，置于37℃培养2周，观察是否有浑浊或pH变化。培养一周及两周后，分别取0.1ml液体培养液涂于琼脂平板上，倒置于厌氧缸中，37℃培养至少3周，持续观察是否有支原体菌落出现。
另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液涂于琼脂平板上，37℃厌氧培养3周，持续观察是否有支原体菌落出现。
另作正负对照组，正对照为Acholeplasma laidlawii（ATCC 23206）与M. arginini（ATCC 23838）。负对照组为待测细胞的新鲜培养液。
支原体生长较慢，所以先在液体培养基中培养1-2周增殖后再培养于琼脂平板上，至少培养3周后才能断定是否有支原体污染。所以总个测试要5周才知道正确结果。
典型的支原体菌落是荷包蛋形，是由于支原体网琼脂下层生长所致，为无色透明菌落，大小约为10-55μm 。但是并非所有支原体都是荷包蛋菌落，有些是圆形或类似黏菌类形态。
区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自琼脂平板上切下，重新培养于液体培养基中，培养一周后再接种入琼脂平板，细胞和菌落则不会生长。
* 本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库